Q：蛋白不表达或表达量很低？
A：
1、选择正确的表达载体与表达菌株
• T7启动子的载体(如pET系列载体)应选用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7启动子的表达载体 (如Tac启动子的pGEX、pMAL系列表达载体) 应选用BL21表达菌株。
• 对细胞有毒性的蛋白，建议选用背景表达低、严谨调控诱导的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。
• 对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，建议选用Transetta(DE3) 等菌株。
2、尝试不同的表达载体与菌株
不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一蛋白无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它菌株或表达载体。
3、表达条件的优化
• 选择不同的培养基。对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明显提高表达量。
• 较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。但可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
• 细胞的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD600值监测生长状态。对于大部分蛋白，应在菌株的对数生长期(OD600=0.5) 进行诱导。
Q：目的蛋白不可溶，形成包涵体？
A：
首先确认目的蛋白是否有表达。
• 裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，是否形成了包涵体。
• 包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达载体与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
• 目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件，如降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD值等，以减缓蛋白的积累。
Q：目的蛋白大小不正确？
A：
• 蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白，从而准确判断蛋白分子量大小。
• 确认蛋白表达是否完整，蛋白是否提前终止表达。
• 若形成二聚体甚至多聚体，可以通过加热变性蛋白、打开二硫键 (加入DTT、β-ME等还原剂) 等手段，破坏次级结构，准确判断分子量大小。
RNA纯化常见问题解答
Q：提取过程中 RNA 降解
A：
• 材料中的 RNA 发生降解：尽量选择新鲜的材料，材料采集后应迅速用液氮处理。材料
保存在液氮中或 -70℃条件下，材料均不宜长期保存，且避免反复冻融。幼嫩新鲜的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受损的材料中 RNA 降解比较严重。
• 操作环境的 RNase 污染：RNA 提取尽量选择洁净的环境，由于自然条件下空气中含有较多的 RNase，建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。
• 提取用具带来的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理严格去除 RNase 后才可使用。
• 操作中带入的 RNase 污染：人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人
员可通过经常更换一次性手套，佩戴口罩等措施减少此类污染。
Q：RNA 提取量低
A：
• 材料 RNA 含量较低：对于 RNA 含量较低的纤维组织 (肌肉组织或纤维素较高的植
物组织) 可适当提高起始材料的用量。
• 材料中蛋白和脂肪含量较高：蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。
• RNA 沉淀条件不合适：使用异丙醇沉淀 RNA 时，加入的异丙醇与提取液的比例为严
格的 1:1，否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因组 DNA 污染
A：
• 材料中核酸含量高：脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高，可进行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理，降解 DNA。
• 材料过量：增加试剂用量。
• RNA 沉淀条件不合适：使用异丙醇沉淀 RNA 时，加入的异丙醇与提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 样品降解
A：
• RNA 样品反复冻融：反复冻融会使 RNA 片段断裂，影响 RNA 的完整性。
• RNA 样品保存条件不合适：根据保存时间和材料的不同，RNA 应保存在不同的溶液中。
如从胰脏、肝脏等 RNase 含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的 RNA，而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。
