Q：层析柱堵塞？

A：待纯化蛋白样品中存在固体杂质，多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤 (0.45μm) 处理。

Q：目的蛋白不与介质结合？

A：

• 目的蛋白没有 His 标签，其原因可能是载体构建有误、表达提前终止 (C端融合表达His 标签)、二级翻译起始 (N端融合表达His标签)等等。建议测序检查，或尝试更换表达载体。

• His标签折叠在蛋白质内部没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建

议充分变性蛋白，可以尝试使用更强的变性剂 (如用6 M盐酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶剂 (SDS) 或还原剂 (DTT、β-巯基乙醇) 等方法。

• 缓冲液存在问题。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介质纯化 His 标签蛋白时，平衡缓冲液与样品缓冲液中的某些组分可能会干扰目的蛋白的结合。

部分组分建议浓度如下 ：

 EDTA: ≤0.1 mM (建议不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)

Q：洗脱液中杂蛋白多？

A：

• 洗脱条件不合适。建议使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同，需要摸索优化。

• 杂蛋白与介质存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 (推荐浓度 : ≤20 mM，因蛋白而异)，抑制非特异性结合。

• 杂蛋白与目的蛋白存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、还原剂 (β- 巯基乙醇 : ≤20 mM） 等组分。

• 目的蛋白降解。建议在低温下纯化目的蛋白，并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂 (如 PMSF)。

• 存在表达提前终止 (C 端融合表达 His 标签) 或二级翻译起始 (N端融合表达 His 标签)。建议更换表达载体。

Q：目的蛋白没有洗脱？

A：

• 目的蛋白量太少，无法检出。建议更换灵敏度更高的检测方法，如用银染法或 Western Blot 替代考马斯亮蓝染色，或优化上游表达条件，获得更多的目的蛋白。

• 目的蛋白没有结合介质。建议检测以下全部样品以确认蛋白：上样前、流出、洗涤、洗脱。

• 目的蛋白结合牢固。建议增加洗脱强度，如采用更高浓度的咪唑或更低的 pH 值。