Q: 扩增效率低：条带较弱或无扩增

A：

• 酶的原因：实验表明，PCR酶对于DNA具有一定的偏好性。如使用一种酶经过优化难以获得理想扩增时，可以尝试其它PCR酶。

• 模板引物的原因：确保模板、引物的品质，保证没有降解。另外，如果模板含有较多的抑制物时（如植物基因组模板），推荐使用抗抑制能力强的PCR酶；还可以对模板进行梯度稀释后扩增，摸索合适的模板用量。

• 反应体系与条件的原因：增加循环数、降低退火温湿度、适当提高Mg2+工作浓度，都可以提高扩增效率，但同时会导致特异性与保真性下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。

Q: 扩增特异性差：引物二聚体、杂带、拖尾等

A:

• 选择热启动酶：与普通PCR酶相比，热启动酶具有更高的扩增效率和特异性。

• 优化反应体系与条件：升高退火温度可以有效提高特异性。另外减少循环数、适当降低Mg2+工作浓度，也可以提高特异性，但都会导致扩增效率的下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。还可以尝试某些特殊的程序，如巢式PCR、Touch          Down PCR等。

• PCR产物需要进行后续实验时，如果确定有目的条带扩增，可以凝胶回收目的条带。

Q：扩增保真性差：突变、插入、缺失等

A：

• 选择高保真酶：B型DNA聚合酶，如Pfu系列酶，具有3’-5’的外切酶活性，能够校正错配的碱基，具有高保真性。另外，复合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在，也具有较高的保真性，但保真性比B型DNA聚合酶要低。

• 优化PCR体系与条件：适当增加模板量、减少循环数，可以降低突变机率，提高保真性。

确认保真性低的原因：有时保真性低并非由PCR引起，PCR通常只会导致数量很少的单碱基突变。如果产物测序后，发现大量的突变，或有明显的插入、缺失等，很可能是来自其它实验步骤，如DNA在大肠杆菌中复制是发生重组，或是测序时的污染。这种情况，可以重新反转录或选保真性更高的反转录酶。

Q：Pfu酶扩增如何加“A”？

A：

• 在10 µl体系中，加入纯化后PCR产物、0.2 µl Taq DNA Polymerase、0.5 µl 10 mM dNTP (或0.5 µl 2.5 mM dATP)、1 µl 10xTaq Buffer， 72℃ 反应10-15分钟即可。

Q：出现假阳性扩增

A：

• 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

• 靶序列或扩增产物的交叉污染：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。