Q：不酶切或酶切不完全

A:

• 酶失活或浓度过低：用已知含目的酶切位点的对照 DNA 测试该酶活性；酶应贮存于 -20℃，-70℃时会冻结；避免反复冻融降低酶活；可根据实验要求适当加大酶

量。

• DNA 浓度不合适：推荐 50 μl 反应体系酶切 1-2 μg DNA；DNA 过量时可适当增加酶量。

• DNA 被抑制剂污染：与对照 DNA 样品一起酶切，验证其是否被抑制；重新纯化 DNA 样品。

• DNA 可能形成超螺旋：不同酶对超螺旋结构 DNA 消化效率不一样，可适当加大酶量。

• 识别位点过于接近 DNA 末端：一般在识别位点两端各加 6 个保护碱基可确保酶切效率。

• 识别位点不存在：验证 DNA 序列。

• 反应条件非最优化：缓冲液使用不当；按比例使用新鲜缓冲液重复实验；按照推荐方案进行双酶切或分步酶切。

• 甲基化封闭酶切位点：PCR 产物未甲基化；使用 dam-/dcm-菌株转化。

Q：出现非预期带型

A：

• 确定正确带型：酶切产物与对照 DNA 样品一起电泳，确定是未消化完的底物条带或者是星号活性产生的非预期条带。

• DNA 样品污染：重新制备或纯化样品

• 含其它酶切位点：验证 DNA 序列

Q：DNA 电泳呈弥散带

A：

• 酶与 DNA 结合紧密未完全解离：使用随酶提供的 DNA Loading Buffer 上样电泳；或另加入终浓度为0.05-0.2% 的 SDS。

• 核酸酶污染：制备新的底物样品；使用新的缓冲液和水。

• 电泳条件不合适：使用新鲜的电泳缓冲液和凝胶；合适的电流电压避免过热。

Q：星号活性 (特异性降低或改变)

A：

• 高甘油浓度 (>5% v/v)：酶储存液含 50% 甘油；因此酶量不超过反应体积的10%。选择 50 μl的标准反应体系，以减少反应过程中水的蒸发而提高甘油浓度。

• 非最适缓冲液：尽可能使用推荐缓冲液，离子浓度和 pH 的改变会引起星号活性。

• 存在有机溶剂 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等)：确保样品在制备过程中不含任何有机物，如 DNA 制备过程中可能混入的乙醇。

• 混有其它二价离子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除样品中二价离子